- 发布日期：2024-10-26 05:26 点击次数：132
卵白纯化素养指南（）
摘自中国色谱网
1) 白酶切割后却发现宗旨卵白莫得活性。
请我咫尺手头有个会通卵白，纯化的时候用助溶剂融解后作念了GST亲和层析，之后用蛋问有哪些可能会出现这种原因？若何护士？测过基因序列，莫得问题。细胞落空后，会通卵白在千里淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST作念亲和层析，但效用惟有50～60％足下。洗脱完会通卵白不需要助溶剂，但这样的条目下切割完后宗旨卵白会千里淀，我用0.5％CHAPS助溶可凑合融解部分，宗旨卵白疏水性比较强。
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇抑止极性，这样融解就会好得多，此外你也平直加2%的PEG这样也抑止极性，同期保护你的卵白，你再作念纯化就可以了，我以前遭受这样的卵白是用10%的酒精加3-5%的PEG5000，这样的情况下卵白如故活性回收率很高，我以为那些名义活性剂能无须如故无须的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底那处失去了活性，这样更容易护士你的问题。还有防护缓冲液PH值，望望篡改它对融解度有莫得影响。卵白有千里淀那你可以略微把卵白的浓度抑止点，这亦然个办法。
2) 请问楼主有莫得合成过配体为FMN的亲和胶？
亲和的填料合成过20来种，你是但愿用它来纯化某种脱氢酶吗，我看FMN可偶联的有限，倒是FAD有辉煌的氨基好偶联，何况它们简直是消亡个辅酶，你是不是磋议把FAD连上去.自然FMN的结构上也有个仲胺，可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上，而溴化氰活化或别的活化的介质齐不大好，因此我以为这个莫得什么问题.
此外如果是以FMN为辅酶的，那我还可以建议 你试试蓝色琼脂糖凝胶，因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似，它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了，有现成的.
我曾经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，咫尺一般要我方合成婚和填料，有好多公司齐提供活化好的介质，我方偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最佳选拔有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外曾经经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选拔性有别离，因此你可以选拔我方得当的活化介质。
不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，是以要对我方的配基了解比较了了就可以选拔合适的活化介质。
我一般在合成的时候大多选拔环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基齐可以，况兼合成的介质刚性好，非特异吸附少，是以不需要极度处理未反应基团。此外键合的键很褂讪，配基零星少。我以为是可以的选拔。
谅解体的卵白复性作念得未几，但是我难忘有个哥们说最管用的办法亦然最松弛的方法，他说在复性的时候尽量别想什么太高难的工夫，那些斯文但不一定好用，常用的有透析复性，稀释复性，包括海外的群众也这样说.我以为有时候最先摸不出来或许便是方法不行，要道要常常篡改条目.
层析复性很斯文，但是信得过能用的不好多，我以为卵白这东西难就在于大多齐不疏浚，是以要道要多看文献，多琢磨我方卵白的本性，多尝试。
3) Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度次序如何？
公共别客气，除盐对于浓度应该亦然有一定的斥逐的，雷同的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不外要除得很干净如故尽量少上点样品，我以为上样的体积毕竟比浓度的影响更大。
4) 我的卵白17kd足下，能跟肝素亲和，一般用离子交换和亲和层析纯化，
咫尺我用聚乙二醇修饰它 ，分子量增多5000足下，修饰率不可能达到100％，请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开？（自然修饰后还残留有聚乙二醇，这个小分子也要除掉）
他们大多用凝胶过滤，我以为这也可以的作念法，毕竟PEG是链状的分子，在柱子上和普通卵白行为不一样，修饰度越高那么出峰也越后，因此你的卵白选拔sephadex G50试试，它的范围在1000-30000，应该是可以的选拔。此外PEG是个疏水性的链，修饰后的卵白疏水性增强，修饰度越高，疏水性越强，可以用这个道理分离。离子交换也可以选拔，因为雷同兴趣，修饰度越高，电荷被屏蔽也越多，电荷也越少，因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的兴趣，你可以试试，你手头的亲和能不行分开，你在这几个方法里选拔看哪个更经济好用就可以。
5) 我是个生手，谢谢楼主给我护士了许多难题。
我有个问题困绕很久，从细菌中提取酶，好象用惯例的方法（超声波破壁，缓冲液提取），老是拿不到我要的卵白。是不是这种卵白亦然疏岁水性较强，需要加助溶剂才能提取出来？另外，我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取？
其实这个问题我以为是这样的，既然你是提取那信托是有千里淀和上清，你的计划卵白的分子量你是应该知谈的，那么跑电泳先看它到底是在上清如故千里淀里，剩下的问题你再护士如何提取。
对于不同的酶要看酶褂讪如何，你可以用不同的PH去提取，我曾经提取一个酶用水便是提取不出来，需要用盐才能提取出来，多试试，想象个决策，这样才能护士问题，是以不一定加甘油就管用，你还得防护落空自己会不会有问题，倒且归作念作念也许能找到信得过的原因。有什么问题不绝探讨。
6) HPLC是用来分析检测or分离纯化？
如果可以用来纯化，上样量那么小有什么道理呢？
如果是用来分析检测，若何带领以后的分离纯化职责呢？
HPLC既可以作念分析也可以作念制备，纯化上样量小，这样分离成果好，就可能得到很纯的物资，同期相助质谱等就缘何得到好多单一卵白的本性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法作念不到的。HPLC重现性好，定量准确，是以也可以用于定量和定性，是分析中不可短缺的用具.
分析出来后如果这个物资很褂讪，平直线性放大就可以作念大范围的制备，因此摸好了分析的条目也就相应有了制备的条目。
7) 诓骗蔬水性质，用反向HPLC方法分离的道理？（包括洗脱液的选拔和谁先被洗脱下来等），请chromatography兄迁延点。
反相和疏水齐是依据物资的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，抑止它的极性洗脱，选拔主如果依据填料的特色以及样品自己的特色而篡改的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的10%足下，其他的齐是亲水的，而反相正巧相悖，它的名义全是疏水基团，因此疏水一般需要高盐吸附，低盐洗脱，反相一般用甲醇水乙睛水吸附，洗脱是渐渐增多有机溶剂的量.由于以上的原因，疏水比反相要柔顺，卵白一般不变性，由于填料多为琼脂糖凝胶，是以卵白回收率高，而反相得行为念分析多，也有作念制备的，那亦然一些分子量相对小的多肽，反相的回收率也低， 因为硅胶杂吸附的原因.
疏水色谱是纯化卵白的另一个有劲的用具.
8) 乞助，我有一段小分子量的卵白，5KD足下，4对二硫键，指令抒发后以谅解体容颜存在，请问，我若何想象我的纯化步地？我用过离子交换柱，纯度可以达到60%，但是不知谈下边该若何作念？望赐教!
这是我的电泳图谱，第8条泳带的最下边便是我的宗旨卵白带，我需要复性，这是一段杀菌卵白，我要复性之后作念抑菌圈。我用的pET-3C的载体，BL21抒发
你好，我作念复性未几，你可以依据相关有多对4对二硫键的卵白复性的道理看这方面的文献，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比作念的，还有用分子伴侣，你可以多望望再尝试：）
至于纯化，如果你的卵白有游离的巯基，那我以为很时候用以前的共价层析，专门对于巯基进行纯化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知谈咫尺还有莫得这个填料，你可以问pHarmacia公司的东谈主。你pM给我，我可以把这个材料发给你，如果莫得，那你只好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知谈是什么道理，作用于什么部位，和什么麇集，那也许可以用亲和的方法，我以为以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同期是谅解你可以先把谅解体融解，然后抑止变性剂的浓度，这样雷同分级千里淀，你就可以得到很纯的谅解体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级千里淀谅解体，再作念纯化。这样省事点。
9) 我想用一个短肽（5肽）作配基亲和纯化一个可与它特异性麇集的卵白（67kda），用什么填料比较好，您有什么好的见意？谢谢
对于小分子的配基我以为需要有一定的亲和手臂，不然由于位阻很难有很好的分离成果，说到活化填料的选拔我多说几句，大多东谈主齐会选拔溴化氰，但是这样作念的介质一般杂吸附多，此外莫得亲和手臂，是以对于小分子的配基有时候纯化成果不好，此外自己对介质也莫得交联作用，是以刚性也差，如果常常用顶点pH洗脱配基零星也多，这是它的一些污点。
环氧活化的琼脂糖凝胶可以有好多的手臂选拔，刚性也好，莫得非特异吸附，形成的键比别的活化方法更褂讪，因此合成的亲和介质性能更出色，你可以选拔这样的方法，偶联很松弛，你pM你的邮件给我，我可以把一些材料发给你，供你参考。
10) 我咫尺作的一个卵白药物的分子量简短是7000， 等电点4，咫尺要去除内毒素有何松弛可行的方法？（此卵白曾经纯化好，但测验内毒素不外关）
你用过分子筛吗？superdexG75对你这种卵白比较合适。作念之前请先用1MNaOH 1ml/min均衡2小时。这种方法除内毒素，荒芜有用。
如果问题请与我议论。myhok@sina.com，咱们以前往除齐是用去内毒素亲和的填料平直加到样品中震动40小时足下，就可以，可以作念到<10EU/mg
11) 请问HPLC是在卵白复性后作念比较好，如故在HPLC之后再来复性？？？
复性作念得未几，柱上的复性更少，但是就嗅觉而言如故尽量在柱后复性，因为这样好放大，况兼容易操作，对于HPLC的柱子很容易因为千里淀而堵柱子，包括很高的变性剂对机器也不好，也可能因为流速慢而结晶堵住管谈等，很复杂，固然有一些这样的例子，但是我以为信得过操作如故贫寒，何况这样作念的量也不大.是以如故选拔纯化后复性吧.
12) 我想问问：我把小分子偶连到填料上纯化其兔多抗，用什么麇集缓冲液和洗脱缓冲液好？
我咫尺拟的是：
Binding Buffer:
20mM Tris，1M NaCl，pH 8.0
Elution Buffer:
50mM 柠檬酸，pH 3.0
应该莫得问题，如果挂得不好，你可以把Binding Buffer中的1M NaCl去掉，不知谈你用什么活化的载体，如果是CNBr，那就得加，但是咱们发现存时候盐也可以洗脱下来东西，你试试再说吧.
洗脱你可以用pH 5.0 4.0 3齐试试，如果在高一丝就可以洗下来，莫得必要用太低的，怕对活性有影响
13) 这段在用离子交换柱纯化卵白，我想问一下，洗脱选择的离子强度的大小范围，应该如何信托，可以把柄什么来调遣洗脱时的离子强度
一般选择的盐浓度的范围在0-2MNaCl之间，若何信托得相助你的洗脱的峰的电泳斥逐来信托，最平直的便是你的计划卵白，如果在很早就出来，那你洗脱的盐浓度（离子强度）就无须太大，如果出来的很晚或一直莫得出来，那就选拔更高的盐浓度。
自然你也可以选拔用阶段洗脱的方法，这样比较容易放大，分离成果其实也可以，固然摸提取贫寒点，但是重现性好，也一样可以作念得很纯，况兼能很精准知谈在若干浓度下洗脱出来。我比较心爱用这种洗脱方法
14) 你好：我有一个困惑了好万古间的问题，想请问。我的卵白是2KD，在作念非还原电泳时，发现除了宗旨卵白外，有二聚体和多聚体存在。宗旨卵白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在作念反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（宗旨卵白的位置），出峰时期为13分钟，第二主峰占10%，出峰时期为3分钟。请问在作念HPLC时天天影院，二聚体和多聚体是否发生篡改？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的宗旨卵白纯度天天影院，是否不当？我用柱子是C4柱天天影院，5υm，300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我以为卵白的团聚应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如斯，那团聚体在反相上能有这样大的别离吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后头的峰齐跑电泳看是不是齐是卵白，如果第一个峰亦然卵白，那证据你推断是对的，如果不是，那便是莫得分开。
我以为测定团聚体如故用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该可以，反相你可以查查文献有莫得这样检测的。
咫尺检测protein aggregation的方法主要有四种。
1。gel filtration. 把柄专门的mark，可以推断大致的团聚物的分子量，不外本色应用上看，影响的身分太多了，斥逐很不精准。
2。native gel. 大致上可能可以推断团聚的进度，不外斥逐实在不行让东谈主信服。平方要与其他斥逐相助证据问题。
3。Dynamic light scattering：松弛方便，斥逐真是，常用于挑选卵白结晶的条目。但是对于浓度有斥逐。
4。超高速离心。
文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein， and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1，2联用的，不外仅用于证据次要问题。
15) 请问大驾：我想把一种配基承接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水夹杂溶液中才融解，似乎看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。
实足莫得问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，是以它们自己不会影响到活化后的琼脂糖的，相悖在有机溶剂中环氧基团更窒碍易开环。是以你无须挂牵，你的配基褂讪的话你可以用0.1MNaOH溶液夹杂你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。
16) 最近我在用sephadexG-75的胶纯化卵白，统统膨大了3次新胶（其中第一次是一个批号，后两次是消亡个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4渡过夜，第二次是按照安玛西亚上的时期90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，莫得加BSA，第三次同第一次作念法，斥逐发现，第一次的胶一最先的流速很快，把柄证据书上给的线性流速可以达到37cm/h，况兼分辨率很高，但自后两次，线性流速最快的时候也惟有17cm/h，分辨率低得多，不知谈是什么原因？？？？（咱们用的玻璃管齐是一样的型号）
这齐很正常的处理当莫得问题，但是还放在120度高压锅内灭菌不知谈行不行，此外你用什么液体处理的填料呢，pH是在中性吗，在酸性和碱性条目下有可能会使结构龙套的，你可以测定一下.如果pH莫得问题，那应该说填料自己莫得问题.至于流速你的样品会不会比较粘，你柱压高不高， 如果柱压高，那填料变形压缩，那流速自然慢，况兼分离成果不好，你的样品会不会有核酸或多糖，这样会影响的，因此你如故望望柱床体积有莫得变化，如果松开很显豁，那你就再行装柱子.
17) 咱们用c-18反向柱纯化卵白，用的流动向是1%三氟乙酸，乙腈，不知谈这两种东西，在什么浓度对卵白有变性作用。
反相一般齐是作念分析的多，除非你的卵白很褂讪，不然不大得行为念纯化，因此在有机溶剂中齐有变性的可能，一般10%足下短时期应该莫得问题，高了就很难说了，自然这也很卵白自己关系很大，如果你真的想纯化，那建议如故改C3或C4这样柔顺点，你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱，也许会好点，你可以相助你的活性测定找到一个合适的浓度使你的卵白活性回想率更好，纯化过程一定要快这样也抑止变性的可能.
18) 我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50％硫酸铵千里淀，然后上HiTrap desalting脱盐，再过MonoQ强阴离子交换柱，用IFA检测抗体活性，合并网罗峰，临了进行透析。第二次纯化时，是平直将腹水上脱盐柱，莫得经过硫酸铵千里淀，斥逐两次纯化斥逐，第二次所的卵白浓度是第一次的三倍多，纯化的抗体我主如果用来作念胶体金标记，请问两种纯化过程， 抗击体的纯度会有什么影响，是否会对标记成果产生别离？
腹水中应该有一些脂溶性物资以及一些别的杂质，千里淀后应该更干净点，平直过柱子要防护清洗，至于这两个方法具体成果如何，你可以跑电泳检测，同期也可以作念抗体的活性检测，如果莫得什么别离，那自然是回收率越高越好. 具体若何样惟有检测后才知谈.
19) 用HPLC分析得到的斥逐对咱们用普通的层析柱纯化有什么带领道理吗？
我以为有道理如凝胶过滤的柱子，那可以知谈分子量的散布以及别的信息，而如果是反相可以知谈哪个卵白的疏水性强，用离子交换的柱子可以知谈电荷的不同，总之了解的信息越多对纯化越有用，是以说齐是有道理的，只是很少有先作念HPLC后作念纯化的，大多先纯化后用HPLC分析.
20) 离子交换层析，一般用氯化钠洗脱，可以用氯化钙洗脱吗？
莫得问题，是盐齐可以，只是留神钙离子容易和磷酸盐产生千里淀，你可以用别的缓冲液就莫得问题.
21) 我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种比较好，用什么流动相，PH 若干为好？宗旨卵白是2KD。
别客气，其实高效凝胶柱子一般用TSK系列的最多，你可以望望有莫得分离范围窄点的柱子，就怕难有分离范围这样小的凝胶柱。流动相用缓冲液就可以。其实按你的分子量，用反相举例C3或者C4更合适，你也可以平直用C18的试试试，凝胶柱很贵，如果用不了那不是可惜了。
补充一下，由于分子量小，可以用MS来计算disulfide bond是否形成。形成一个，分子量减少2（失去两个proton）。
至于复性，建议在纯化之后进行。有文献证明，卵白复性，告捷的可能随纯度的升迁而升迁
因为HPLC用的填料一般是5-10um的，而平方用的填料至少也在35um以上，分离成果别离如故很大的，如果要把这样细的填料装在普通的柱子上，压力很大，一般的泵和系统，包括柱子根底承受不了那么大的压力，此外普通的层析系统的泵的精度管谈等齐很难保证有很高的分离成果，但是你可以把HPLC的条目平直用普通的填料来放大制备，举例你摸好了HPLC的反相或者亲和以及离子交换的填料，如果它们有相应的颗粒大的普通的填料，那就可以平直用HPLC上的条目，这样只消你HPLC的条目很好，那就可以，但是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大，它也莫得相应的填料.
22) 你所说起的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及分辨率，具体何解？
我以为是这样的：凝胶过滤的道理是小分子能参加的孔到多于大分子的，但是如果有多糖或核酸的阻挠（很粘），这样一些小分子也不行参加更多的孔（和莫得阻挠的比拟），这样自然分离成果不如莫得阻挠的。这是其一。
其二是由于这些东西粘度大，那么雷同流速下，由于sephadexG-75压力比平凡的大，是以胶会压缩变形，这样它的内孔和莫得阻挠的排阻极限也不同，是以分离成果自然比莫得阻挠要差。荒芜是压缩会使孔变得不均匀。
自然相对而言，前边的原因是最主要的，后头是次要的。
其实不仅是凝胶过滤，别的色谱有这两物资（还有一些脂溶性的物资）也会一样阻挠传质，因此影响分离成果。是以这两个东西一般要留神，同期它还会抑止柱子的寿命。
23) 我的宗旨卵白是以可溶容颜抒发，MW=６KD，表面等电点为9.45．，无tag．我先用S-100裁撤了部分杂卵白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现宗旨卵白根底挂不上．我想试用硫酸铵分级千里淀裁撤部分杂卵白，再过s-100.但不知硫酸铵分级千里淀该如何具体操作？
你可以先把缓冲液pH调到6试试能不行挂柱，此外其实你的卵白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你平直过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后头，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质莫得前边说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和卵白沿路出来的，你测定样品的电导望望。
硫酸铵分级千里淀的方法其实很松弛，一般便是用浓度从低到高的硫酸铵去千里淀卵白，你可以平直在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心千里淀，上清不绝加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以想象你的实验，然后用电泳检测或者活性检测千里淀的成果。
24) 如果怀疑是多糖酿成的黏渡过大，请问应该如何去向多糖？
多糖去除你可以用硫酸铵分级千里淀，也可以用低温酒精分级千里淀.一般的多糖也不带电荷，你可以用离子交换挂住你的卵白，这样亦然可以的
25) 问一个相关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别东谈主拿去用了，用了一次，斥逐我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有莫得坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它还原到原状？
这个絮状的东西有色调吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西莫得处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，千里淀后倾去上清，作念三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不行洗回想，如果不行很好千里淀下来，那就不行用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的酒精中。
26) 我想在想纯化peg修饰的卵白，但是我咫尺惟有弱阳离子交换的羧甲基纤维素，你看能不行纯化阿，好像文献上齐用sp-sepharose，纤维素是不是不行啊？另外，咫尺莫得专门的层析安装和蠕动泵，我用普通的层析柱是不是就可以阿，流量是不是也无须太精准阿？谢谢！
离子交换的方法是可以的，但是我以为疏水也很值得一作念，因为修饰后电荷变化了，其实疏水性也增多了，是以这些方法齐可以，此外只消你的CM纤维素能挂住就可以分离，，SP-sepharose只是更强点，况兼流速更好点，你先试试，不行再换吧。莫得蠕动泵纤维素流速会比较慢吧，流量信托不精准，我以为如故有个泵好点，莫得检测器也不行，这些是纯化的基础，要不但是比较贫寒的，怕实验难相通。何况你莫得泵也莫得办法作念线性剃度洗脱。反恰是太松弛点。
27) 问一个相关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别东谈主拿去用了，用了一次，斥逐我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有莫得坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它还原到原状？
这个絮状的东西有色调吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西莫得处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，千里淀后倾去上清，作念三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不行洗回想，如果不行很好千里淀下来，那就不行用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的酒精中。
28) 率先我想问一下agarose和sepharose区别，我的默契是:齐指琼脂糖，但agarose是未承接其他介质的，而sepharose是承接其他介质的，不知默契对分歧?请赐教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一种东西吗?
其次，我想问一下你纯化过GST会通卵白莫得?我现纯化一个会通卵白(某种酶和GST会通)，我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升，但我不知若何作念.分子克隆说平直将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不可以这样作念.而家具证据书上说作念柱子，我就想1毫升的柱子若何作念，装介质的柱子的高度和直径有要求吗?
agarose是平方的琼脂糖的英文称号，公共齐这样叫，它不是商品的注册称号。而sepharose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品称号。是以你默契是有偏差的，此外agarose不一定是琼脂糖凝胶，而Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是消亡类东西，只是厂家不同。
GST会通卵白纯化过，5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的作念法作念，取决于你的喜好和方便。1ml不好装，除非有专门的小柱子，对于直径和高度莫得荒芜的要求，咱们的作念法是：
1、 GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7X2.5cm，柱床体积为1ml；
2、 用缓冲液1均衡5个床体积，流速为1ml/min；
3、 将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、 用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min；
5、 用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，网罗洗脱峰
6、 用纯水洗5个柱床体积，再用20%的酒精洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存
缓冲液组成：
缓冲液1：20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
缓冲液2：50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 盐酸29.2ml，307mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。
29) 请问con A sepharose 4B 亲和凝胶使用前的处理方法？
不需要荒芜处理，平直均衡后就可以上样了。
30) 谢谢，我想问一下，是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢？如故阶段洗脱好？检测器我想先网罗然后再去测紫外。
也不是，有的时候阶段洗脱成果就很好，况兼容易放大，不需要仪器，我比较心爱，成果差未几，但是很省事.但是要道是容易相通.紫外摊派测定那也可以，我上学也那样作念过.
31) 我要从总卵白中建议250KD的NF1卵白作念western，由于量少是以要作念免疫千里淀。我是诓骗小鼠起头的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、protein A－sepharose来作念免疫千里淀，发现作念完后跑电泳，出现了两条带，永诀位于85KD、55KD足下，请问这会是什么东西？会是抗体吗？还有莫得可能是计划卵白变小了？
对不起，我莫得作念过免疫千里淀，但是抗体作念过一些，抗体重链莫得大到85KD的地步，是以应该不是抗体.会不会你的卵白有四个部分组成，永诀是两个85KD和55KD，这样分子量正巧和你的250KD相等，你可以跑非还原电泳望望，是不是还这样呢.如果不是，那证据是由这两个部分组成的.齐是由二硫键承接的.
32) 我提胰卵白酶，主要参考用张龙翔书里的办法，先提卵类粘卵白，率先过SEPHADEX G-25 柱子脱盐，然后过DEAE纤维素离子交换柱；第二步是用卵类粘卵白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析过程齐可以在缓冲液里面加0.02%的叠氮化钠抑菌吗？以后若何去除？
我提胰卵白酶粗酶用的酒精，可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗？浓度多大为好？
那实验我知谈，你用什么方法活化琼脂糖呢，胰蛋酶的亲和纯化方法好多，配基有大豆胰卵白酶阻扰剂，抑肽酶，苯甲脒类，荒芜是后头的苯甲脒，可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶，何须我方去提取呢，嗅觉比较复杂，我方偶联这些配基也可以，层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌，尽量不要加，那透析或者除盐柱子齐可以，或者平直上一样的亲和柱子，用不含这个的缓冲液洗，临了洗脱下来就可以了。
最佳如故用酒精，浓度很难说，因为和你的卵白浓度相关，别的醇用得很少。此外你可以磋议用硫酸铵千里淀，这样对活性更好些。纯化也可以用疏水，因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附，相助硫酸铵千里淀亦然可以的选拔。
33) 楼主，我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有莫得浓缩作用，以前有东谈主作念过，克也在纯化时，浓缩5-10倍，但是，我却莫得使纯化的卵白浓缩，我想得到浓度较高的卵白，又想省去浓缩这步，楼主能不行指点我一下，缓冲液的流速以及柱子的选拔上有什么要求，使洗脱下来的卵白浓度会较高，
亲和，疏水，离子交换齐可以浓缩样品，但是离子交换是最低廉的，苯基可以浓缩，但是想有好的浓缩成果，最佳用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先用离子交换柱子挂住，然后平直用高盐洗脱，因为不知谈你卵白的等电点，是以不知谈你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后平直用缓冲液洗脱就可以。亲和也差未几这样的。流速莫得太大的要求，柱子看你手头有什么，离子交换是最常用的。上点样
34) 我作念的是青霉素酰化酶，样品盐浓度很高，我是两步纯化，第一步使用氧化铝物理吸附，使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5，0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩，但是成果很差，基本是起不到浓缩的作用.
我作念了好几次，齐是这样，但是前边有东谈主作念的时候起到浓缩的作用，我咫尺却作念不出来，也议论不上以前作念过的东谈主.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析，我咫尺就这种柱子，我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的如故小的，洗脱卵白时会使洗脱的卵白峰值高一些，谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法作念吧，其实只消把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以，但是除盐不好，你想浓缩成果好，你可以把硫酸铵的浓度升迁到2.5M再挂在柱子上，平直用ph7.5，0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的成果好，那尽量用短粗柱子，也便是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料，颗粒细点，肇端盐浓度高点，这样保证能浓缩好你的样品.
35) 楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的接收图谱是若何的？它的特征接收峰在那处，不同的多克隆抗体是不是还有我方的特征接收峰，
对不起，你是说色谱图如故紫外接收图呢，卵白一般齐是在280检测的呀，不同的的卵白固然有一丝别离，但是那也不是很显豁的，其实就用280就可以了.
36) 我的卵白以GST会通卵白的容颜抒发在E Coli中，分子量14~15kDa，卵白的疏水性很强，等电点在7足下。菌落空后，用名义活性剂提取的会通卵白，据文献说是由于此卵白和细胞膜麇集，是以如果不加名义活性剂，上清中电泳检测不到。加名义活性剂后，提取效用还可以。上GST 胶。最先时选择先洗脱会通卵白，再酶切，洗脱选择10mM GSH洗脱，莫得加名义活性剂。然后酶切后，就会产生大宗千里淀，上清中莫得宗旨卵白。自后在酶切buffer中也加名义活性剂，就得到了改善，莫得再出现千里淀，宗旨卵白也存在于上清中。宗旨卵白中仅有一个cys。
我的问题是：
1、雇主不知从那看了篇文献，是专门讲此卵白的结构的。不外东谈主家的卵白是合成出来的，然后用反相C18（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为binding 效用不是很高，GST价钱很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，千里淀后离心上反相分离。我以为千里淀中的杂质组成不很了了，如果有大一丝的卵白变性千里淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些贵府，反相只用来分离或分析短肽，较少用于分离较大的卵白，尤其是我的杂质齐不了了的情况下。
2、当年曾作念过superdex200 10/300分离酶切产物时，由于宗旨卵白荟萃，我也莫得marker，每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相有莫得可能诞生一种粗浅的分析方法来分析纯化过程中宗旨卵白的量？
3、我的卵白酶什么好的测活方法，只可作念细胞毒性本质。有一篇文献说在生理条目下，我的卵白莫得二级结构，尽管在一定浓度下未千里淀，但是齐以多聚体存在，如果加入50% TFE(三氟酒精，trifluorethanol)，则可使其在中性pH下还原二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE退避荟萃么？这样作念有什么把柄么？好象一般齐只用名义活性剂（对细胞有毒性），或L-arg，PEG之类的，可我没找到在L-arg和PEG存不才，宗旨卵白的结构功能方面的文献。咫尺不了了多聚体是否就一定莫得活性？烦嚣阿，望多多赐教！
4、我的GST麇集效用不很高，总有部分流穿（应该莫得越过载量），而减速流速改不雅也不显豁，自后麇集的时候binding buffer中也加名义活性剂略微好一丝，但如故不恬逸。我曾试过把流穿网罗再进GST柱，但是简直不麇集，是以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一著述，提取时选择离子型名义活性剂，binding时在加入triton X-100，选择夹杂名义活性剂，听说可以使GST部分复性，增多binding，我还莫得试过。
您有这方面的素养么？多谢了
1，其实反相价钱会更好点，因为有机器，柱子和流动相也未低廉，其实咱们用的是国产的GST会通卵白的纯化系统，价钱就不贵，你PM你的邮件给我，我给你一份材料，反相柱子其实作念不了若干东西，是以建议你别用它制备.
2.只消你有尺度卵白，那用HPLC作念分析代替电泳是很可以的，因为这样时期裁汰了，效用更高，况兼定量很准确.
3.三氟酒精我的主张是抑止了极性，这样你的卵白不会因为(环境极性大)疏水互相作用太强和荟萃，至于活性那你多查文献看有莫得别的测法了.
4.至于你柱子挂得少，那有可能是因为有些计划卵白的结构和能挂上的不一样，那你可以试试抑止上样的浓度，包括抑止疏水性，加名义活性剂望望，这个不作念怕是不知谈的，因为只消GST莫得活性或被屏蔽，那信托挂不上.
37) 色谱兄能否保举几种可以的离子交换介质呢？我咫尺知谈有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能保举一下比较可以的介质吗？物好意思价廉的，谢谢！
维素不好操作，如故用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
38) 一是电泳后凝胶里面德卵白质有什么可靠的方法回收？
二是我咫尺有个GST会通卵白，用thrombin酶切后的宗旨卵白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法护士
还真莫得作念过，你可以用电洗脱的方法，然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩，就怕这样会变性了.
你酶切带弱，那可以尝试增多酶的量，或延迟酶切时期，.此外看有pH有莫得问题，你的卵白浓度是不是太低.
39) 我所说的大颗粒是指卵白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。谢谢！
实足莫得问题，我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐，也纯化过，这样可以把好多小分子的卵白去除，再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒齐可以，那大分子的卵白也莫得问题，包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.
40) 谢谢chromatography的恢复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘肽还原酶，文献齐是用2'，5'-ADP－Sepharose 4B纯化，以后你多钟情点，
别客气，我的真义是你用兰色琼脂糖凝胶试试，此外有谷胱甘肽琼脂糖，应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧，或者专门合成一个雷同底物的也可以，其实你实足可以我方合成填料的.也许这样能很好地护士你纯化的问题.
41) 我用环氧氯丙烷活化琼脂糖，到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶？GOOGLE 搜不到。咱们没冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放雪柜里层析以防长菌和防酶降解，可以吗？
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料，你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，是以不会长菌，不需要抑菌，层析柱灌满20%的酒精，放在雪柜4度中保存很久齐莫得问题。
42) 查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定，而我的条目没办法测是以需要送到别的场所测。这会酿成很大的贫寒，请问chromatography 有莫得东谈主作念过的，有莫得好的方法可以鉴戒？另外一个问题是：诓骗分离纯化这个卵白的填料中有莫得亲和偶联剂？我一直齐莫得查到过。
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮齐有特异的亲和力，你实足可以我方合成一些亲和填料，咱们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质，成果可以，我以为你可以用亲和的办法，即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个卵白.因为它和芳醇环有很特异亲和力.
你说的亲和偶联剂是配基如故活化的填料呢.
43) 请问，如果所提卵白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮千里淀法，但千里淀很难融解，没法往下作了。有莫得更好的方法？谢谢！
那你平直把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好了，你也可以超滤浓缩。丙酮千里淀要在低温搅动情况下迁延加冷丙酮，幸免局部浓渡过高，此外千里淀后随即离心，这样也可以幸免变性而不融解。
44) 三氟酒精我的主张是抑止了极性，这样你的卵白不会因为(环境极性大)疏水互相作用太强和荟萃，至于活性那你多查文献看有莫得别的测法了.
对于TFE对于a-helix的形成，咫尺有两种不雅点。
1。TFE能褂讪a-helix的形成，及这个卵白原来便是a-helix的结构，但是由于dynamic太严重了，或其他的身分，酿成表不雅上看不见。加入TFE能够褂讪之，使之表不雅可见，用CD啊什么可以看得到。
2。TFE能使卵白变成a-helix。及这个卵白原来不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之变成a-helix。
具体的道理我就没仔细读了，不外这两方齐有一定的文献证明，咫尺还不知谈谁对！ ^_^
45) 我是需要在兔肝中纯化一种酶，况兼我是刚刚斗殴卵白纯化我有几个问题想请问:
1 : 我的宗旨卵白在强阴离子柱上麇集(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4)，但是似乎鸠协力很弱(因为上样时就有少许卵白flowthrough，况兼洗脱峰在电导值刚最先升高时就最先出现了)，我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后，卵白的鸠协力好像如故很弱，洗脱峰没多大篡改.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么?
2: 由于宗旨卵白品貌低易失活，况兼实验室浓缩的条目有限，我过了脱盐柱和粒子柱后样品卵白含量低体积大，我想请问:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的卵白在疏水柱上鸠协力很强，老是到梯度最末才洗出来，我该若何优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ，但是由于经济上的原因不行用特异的含配体的溶液洗脱，只好用高盐的洗脱液(含2M KCl)，这样是不是分离成果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我莫得空柱，上不了机器，只可用手奇迹念，这样作念梯度荒芜贫寒)
4:自然的肝脏匀浆梯度离心后，在PH 7.4 的磷酸盐均衡液下，为什么绝大部分(95%以上)卵白齐麇集不上去呢?我最佳要把PH值降到若干去试?6.8合适么?
谢谢你的带领!!
1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子，同期pH调为8.5，这样可能会好些，此外如果如故很弱，那你可以用Q柱试试.升迁pH应该有用，但是有的卵白吸附力弱，是以盐一高挂不住，因此要抑止到5-10mM也许能更好点.
2.大体积平直上疏水莫得问题，既然你的计划卵白是临了出来，那你可以用0.5-1M盐洗去杂质，然后用0.1M洗脱，根底不需要走梯度，这样快，分离成果也不差，况兼这样洗脱的体积小，容易放大.
3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗，是染料亲和吗，既然这个填料可以，那么蓝色琼脂糖凝胶也可以，它们齐属于染料亲和，这个应该更低廉点，洗脱用盐没相关系，不需要竞争洗脱，何况那样染料很难去干净.手工洗脱，你可以用阶段洗脱的方法，如你用0.5，1，1.5，2M的盐阶段洗脱就可以，不需要走梯度，只消你多摸索，你会找到个合适的浓度，成果一样很好，莫得问题.
4.挂不上你是指的亲和如故离子交换呢，我想如果是亲和，那你可以抑止pH，同期还一个缓冲体系，我以为主要在pH，你抑止到4-5那挂得就比较好一些吧.
46) 1.我恰是用的Q柱出现的上述问题，
2. red A 照实是一种染料亲和，
3.我说的挂不上是在souce 30 S 和streamline sp上样的体积
4.你用akta的诱导么?我用purifier 100 ，发现电导值老是稍迟于最先的梯度.
1，那你按我提议试试吧，抑止缓冲液浓度，升迁pH值.
2.那它的结构和我说的阿谁染料是一样的吗，你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶，齐是表情，结构也相似.
3，挂不上那也可能，不知谈你挂的是用什么条目，这个酶等电点是若干呢.
4.AKTA便是那样的，因为梯度是从一最先就算，而电导至少要近一个柱床体积才有变化，是以稍迟.
47) 你可以先把缓冲液pH调到6试试能不行挂柱，此外其实你的卵白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你平直过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后头，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质莫得前边说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和卵白沿路出来的，你测定样品的电导望望。
硫酸铵分级千里淀的方法其实很松弛，一般便是用浓度从低到高的硫酸铵去千里淀卵白，你可以平直在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心千里淀，上清不绝加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以想象你的实验，然后用电泳检测或者活性检测千里淀的成果。
多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的宗旨卵白仍挂不上 SP柱（我是一个生手，正在作念卵白纯化．我的宗旨卵白是以可溶容颜抒发，MW=６KD，表面等电点为9.45．，无tag．我先用S-100裁撤了部分杂卵白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现宗旨卵白根底挂不上．），是不是表面IP与本色有出入？
48) 有可能还在柱子上，如果你系数的组分齐检测了莫得活性，那这样的可能性很大，你可以用0.5，1M的NaCl永诀洗脱，再测定这两个洗脱组分的活性望望.你的酶褂讪吗.
我的酶还算比较褂讪，４C下活性至少三天不丧失，也有报谈一周不篡改，－２０C时期就更长了。
49) 问一个可能是比较业余的问题，咫尺我想通过真核表到得到纯的卵白，然后勒诈抗，但是好多东谈主告诉我真核抒发最大的问题便是得到的卵白荒芜难纯化，好多东谈主齐这样说，是以科室里就莫得东谈主去试，本色上我以为通过真核抒发得到纯卵白是最佳的阶梯，是以想问一下，若何样能把真核抒发的卵白纯化出来，谢谢。
50) 多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的宗旨卵白仍挂不上 SP柱（我是一个生手，正在作念卵白纯化．我的宗旨卵白是以可溶容颜抒发，MW=６KD，表面等电点为9.45．，无tag．我先用S-100裁撤了部分杂卵白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现宗旨卵白根底挂不上．），是不是表面IP与本色有出入?
表面上的和本色是有别离，但是不会这样大，你的样品中盐的含量高不高呢，有盐也会挂不住的。
51) 我的酶还算比较褂讪，４C下活性至少三天不丧失，也有报谈一周不篡改，－２０C时期就更长了。
我永诀用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，测卵白浓度如故很低，中间有几个管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有４４１IU／１０ｕｌ，而网罗管里的酌定惟有２０IU／５０ｕｌ。
是以，我很怀疑它到底挂在柱子上莫得，于是我检测了一下上柱后用运行缓冲液洗脱下来的网罗液，发现酶活竟然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是运行缓冲液的离子强度就太高了呢，０．０１１Ｍ柠檬酸－氢氧化钠，PH５．５？然后就用的是手工步进式洗脱，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到自后的０．５Ｍ，１Ｍ．
另外，我还想请问您：
阳离子层析柱用完后如何保存？先用１M氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否保举一下？硫柳汞我这里包装大，２５ｇ，又不行分装，需要避光保存，先谢谢了！
那用更高点的盐洗脱望望，举例2M，如果如故莫得下来，那也许是千里淀在柱子上了，但是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，但是穿透好象有不少，是不是莫得挂住呢。
保存你用20%的酒精过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，莫得必要用硫柳汞。
52) 问一个可能是比较业余的问题，咫尺我想通过真核表到得到纯的卵白，然后勒诈抗，但是好多东谈主告诉我真核抒发最大的问题便是得到的卵白荒芜难纯化，好多东谈主齐这样说，是以科室里就莫得东谈主去试，本色上我以为通过真核抒发得到纯卵白是最佳的阶梯，是以想问一下，若何样能把真核抒发的卵白纯化出来，谢谢。
纯化和抒发系统有一些关系，但是最首要的如故看卵白的本性，是以不一定真核就不好纯化，是以我以为无须挂牵。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，具体很难说，得看你的计划卵白而定。
53) 你好，我想请问一下，我咫尺在作念谅解体卵白的柱上复性和纯化，是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上，但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不行融解，不知谈你是否碰到过这类问题.况兼我的卵白又不行用8M的尿素融解.缓冲液咫尺用的是50mM的磷酸二氢钠，PH7.5.还想请问一下，上样的浓度有要求么?不知谈你有什么好的建议呢，谢谢.
要复性你的卵白浓度就不行高，这样你融解你的计划卵白也就不需要那么高的盐酸胍了，这样你就可以把盐浓度升迁点。上样浓度应该小于0.1mg/ml，具体情况得看你的卵白，我建议你可以用松弛点的稀释复性或者透析试试，如果不是荒芜复杂的复性最佳能用松弛的方法，别过柱子。
54) 不好真义，什么叫穿透啊？不懂唉，请赐教。
另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么真义，谢谢！
所谓穿透便是上样后用及均衡缓冲液洗下来莫得被吸附的部分叫穿透，pK值用于默示酸碱性的强弱，阴离子交换的填料是碱性的，是以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才能带正电荷，用于交换带负电荷的样品，不然就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值，这样它才能解离带负电荷，用于吸附带正电荷的样品.不然也挂不住.
55) 我作念得GST会通纯化，宗旨卵白在66KD隔邻，但每次纯化出来的总有杂带，荒芜是最近的一条带，浓度较大，不管降温如故篡改指令剂浓度遥远去不掉，您有什么卓见，谢谢。
这样纯化的卵白可以免疫动物，莫得问题
56) 向您请问一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)抒发宗旨卵白，宗旨卵白的两头齐带His-tag，卵白的大小为37kD，在诓骗Ni-NTA纯化时老是在宗旨卵白带足下随同一条带去除不了，请问有什么高着可以护士这个问题？!!!此外，该抒发产物为谅解体，请问这种产物可不可以平直用来制备抗体？谢谢！！！
也许这两个齐是你要的计划卵白呢，会不会是这样呢，你可以用his的抗体作念WB望望是不是这样的，如果是，那证据是这样的情况.此外你可以再均衡缓冲液中加0.5%的吐温等名义活性剂，这样可以去除一些非特异吸附，此外你可以用pH45足下的变性溶液去洗，这样也能去掉一些杂质，临了在用咪唑溶液洗脱.如果你这样齐去不掉，而作念WB也有两条带，那证据可能是降解，超声落空的时候功率别太大，时期也别太长，防护温度，因为超声有时候也可能会使卵白降解.
57) 我作念得GST会通纯化，宗旨卵白在66KD隔邻，但每次纯化出来的总有杂带，荒芜是最近的一条带，浓度较大，不管降温如故篡改指令剂浓度遥远去不掉，您有什么卓见，谢谢。
你可以在你的均衡缓冲液里加一些盐，0.2-0.5MNaCl，这样可以抑止一些因为离子作用带来的非特异吸附.同期在均衡液里加0.5%吐温等名义活性剂，这样是不是有点改善，此外你也可以用阶段洗脱的方法，举例用5mM和10mM还原谷胱甘肽去永诀去洗脱，这样望望有莫得什么区别.此外还要防护的问题是超声落空时防护功率和时期.幸免过强时期过长，降解卵白.
此外你可以GST抗体作念WB看是不两个齐是你要的东西，会不会是降解或酿成这样的斥逐。你可以加点酶的阻扰剂，此外对不起我不是主任，嘿嘿。
58) 我准备用30％－60％硫酸铵千里淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在千里淀中。测了一下卵白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
30％－60％硫酸铵千里淀可能对你的宗旨卵白来讲，太和毛糙了，如你所言，宗旨卵白可能在千里淀中，可否分级千里淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再测一下活性可能就分开了，20mg/ml的卵白浓度对于层析是有点高，洗脱液浓度变化或PH的篡改齐会使卵白有亏空，最佳不要越过１０mg/ml。
59) 我的卵白是用pGEX-4T载体在BL21中抒发的，抒发量很高，形成谅解体，为了赢得可溶性卵白，我咫尺尝试用较低浓度的指令剂指令，此前用不同浓度指令作念过对比，电泳后抒发量的各异不大；但当我再抑止温度指令后发现，超声处理后的上清液中宗旨卵白条带很幽微，大部分宗旨卵白如故在千里淀中；这和我抑止指令剂前作念的不一样（同温度），为什么宗旨卵白的可溶抒发会不褂讪呢？对消亡菌种应该是固定的吧？我很诱骗．
另外，请问，一般情况下２８度，３０度指令时期应该永诀若干才合适？咱们的光度计出了点问题，无法测定ＯＤ值．谢谢．
还有，你有莫得较好的卵白纯化的文献先容几篇，好吗？
60) chromatography 兄，请问一个问题:
选拔填料的时候，CM和SP若何选拔？什么时候选拔弱阳？什么时候选拔强阳？
再问一个：
咱们实验室有两种卵白，一种等电点5足下，另一种等电点9足下，为什么齐可以用CM阳离子交换纯化？（用的缓冲液齐呈中性）
等电点5的阿谁我以为选拔阴离子交换柱好些，为什么不这样？
莫得什么荒芜的原则，首如果纯化的成果好就可以，一般齐是先选拔弱的．
纯化是把计划卵白和杂质分开就可以，是以其实在这样的情况下，酸性卵白是挂在阴离子柱上，尔后头的挂不住，但是只消能把它们和杂质分开就可以．是以酸性卵白流穿，杂质被吸附也可以，是以不一定非要吸附也可以．
61) 我准备用30％－60％硫酸铵千里淀透析、离心后去上phenyl－sephorase柱。但发现活性大部分还在千里淀中。测了一下卵白浓度是20mg/ml。是不是浓度太高啊？
也不是，其实千里淀你可以作念仔细点，举例先用３０％千里淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如斯类推，一直到６０％，然后测定千里淀和临了上清的活性，这样就知谈哪样的浓度千里淀成果比较好，既然你的活性齐在千里淀里，那平直融解在一定浓度的盐中，平直过滤上柱子就可以，浓度高也没相关系．
62) 急问：我的样品卵白液原来放在４C保存，谁知有东谈主把温度调到了１８C已有一天，请问这样对卵白会有多大影响？我纯化的是一种酶。另外，树脂在这样的温度下性质会有所篡改吗？某东谈主说４C－３０C的情况下，树脂不会有太大篡改。是这样么？谢谢！
不知谈你的卵白褂讪不褂讪，你可以测定一下活性望望，如果莫得什么变化，那就没相关系，树脂不会因为温度有什么变化的，尤其是你的树脂不是以卵白为配基的亲和填料．，没错在４C－３０C的情况下是莫得若干篡改，但是那也看多万古间，什么树脂，因为时期长会长菌如果不加抑菌措施的话．
63) 我用鼎国的sepharose 4-B 合成婚和柱可以吗？
是活化好的吗，如故普通的琼脂糖，他们的填料颗粒有的比较粗，不知谈你选拔的粒径是若干范围的，最佳要细一些，４５－１６５um比较好，用一般应该莫得问题．
64) 比如说，sephadex G-25的分级范围是1000～5000，我想问一下，分子量小于1000的分子（举例盐）是若何样通过的？它是从凝胶里面通过吗？不是说惟有1000～5000大小的分子从凝胶里面通过吗？
凝胶的中间有的是大小不同的孔，盐自然在这些孔中间通过，而所谓的分离范围也只是说在这样的分子范围内有别离，离开这个范围就莫得分离成果，是以小的和大的齐莫得什么分离成果，因此不是惟有1000～5000大小的分子从凝胶里面通过.而是在这个范围的分子有分离成果.
65) 请问：要从发酵液中纯化出一个分子量约为1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取选择的是酸千里醇提的方法，粗提物中卵白含量39mg/ml。贵府上说，纯化这个小肽要用sephadexLH-20，但是我莫得。：（尝试用sephadax G15 进行了纯化，出现了五个莫得分开的峰，第六个峰分的还算可以。磋议到可能是粗提物中的组分太多，于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化，得到一个单一峰，网罗后，冷冻干燥，再过sephadex G50，得到两个接收峰，但是实验发现，这两个接收峰莫得抑菌活性了：（洗脱液用的是pH7.0的PBS，检测波长280nm。请问可能出现的问题有哪些？洗脱液选拔的有问题？检测波长有问题？｛我的这种多肽，贵府上说HPLC的检测波长为210nm，也有205nm的。｝
你的问题很不解确，用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外，还有一些分派色谱的作用，是以这个介质和sephadax G15 是不太一样的，你纯化出若干峰齐应该进行抑菌实验，不然很难知谈你要的组分在那处.既然这个分子量这样小，那你上sephadex G200，计算你的计划多肽在临了头，是以你得到的阿谁峰不一定有你要的东西，而在后头，我是这样猜测的，要道你要测定活性，是以你再纯化也莫得活性，问题在于你莫得通常作念活性检测，填料选拔不很正确，检测波长我不了了对分歧，要道你要选拔合适的柱子，同期每一步齐作念活性检测.
我照实是对每个峰齐作了抑菌实验，Sephadex G15的每个峰齐有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个接收峰，如果我要的组分在后头，可它连个小峰齐莫得呀.。此外，有东谈主建议我，先使用硅胶柱对粗提物进行处理，请问可供选拔的柱子有哪些？谢谢。
那你莫得证据G200的峰是不是有活性，你也可以磋议硅胶填料，那得选拔c8或者c4的反相硅胶的柱子，可以作念HPLC，这样亦然可以的选拔，毕竟平方的凝胶柱子很难有很好的分离成果。
66) 如果我用sephadex G-25脱盐，如何选拔缓冲液？因为我认为，如果选拔含盐的缓冲液，自己带入了盐，能起到脱盐的成果吗？如果选拔含盐的缓冲液，
缓冲液里含有的盐会临了流出来吗？ 另外，分子筛有莫得载量的问题？
缓冲液选拔看你需要什么缓冲液就选拔什么，莫得什么荒芜的要求.你的缓冲液自然是莫得盐的，不然那何须除盐呢.含盐缓冲液自然不行去掉盐了，它只可把你样品中的盐去除，用的道理是卵白在柱子中走得比盐要快，是以先出来.如果你缓冲液中有盐那固然盐有后出的道理，但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子，是以它的盐是去不掉的，这和样品中的盐是不一样的.
分子筛其实也有载量的问题，但是要道如故看上样的体积，举例分离上样体积不行大于10%柱床体积，脱盐不行大于30%，具体的数和样品有很大关系.
67) 既然这样，我想实足脱盐时，洗脱液可以选拔水吗？因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在，对分歧？
是的，只消你的样品在水中融解得很好，况兼很褂讪，那选拔水就可以.
68) 请问色谱兄，我咫尺用纤维素分离纯化卵白和peg-卵白，跑完我用page检测了一下，莫得实足分开，有一些是沿路流出来的，我想知谈为什么分离成果不好？我该如何调遣阿？加长柱子可行吗？如故要更换介质阿？我用的梯度洗脱。多谢拉！
peg-卵白要想实足分开是比较困难的，因为PEG修饰的进度不一样，所很难实足分开，不外纤维素分离的成果是要差点，你可以通过延迟柱子，抑止流速，延迟梯度的办法来升迁分辨率，不行你可以换琼脂糖系列的，但是我以为你也可以磋议疏水，这两个方法齐可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱，这样有时候分离成果也不比梯度的差.
69) 荒芜感谢色谱兄，琼脂糖的比纤维素的好好多吗？另外，前次你给我了份材料莫得价钱，能否给份有价钱的材料，这样也好和雇主谈谈，因为雇主戒指的挺严，谢谢！！flyhyx@yahoo.com
有的，到时候发给你吧。琼脂糖信托比纤维素分离成果要好，载量也大，还有便是柱床体积不会变化，流速高。
70) 想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何完毕存效分离（制备范围），且不使用plasmidselect之类亲和介质。
亲和是最有用的方法，咱们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以望望。
71) 我所纯化的卵白质大致是66kDalton，进行的亲和纯化。咫尺出现几个问题想请问：
1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下计划带，咫尺50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。
2。因为亲和纯化后我的卵白在最上头，是以我咫尺用sephadex G－100，但是我发现成果很差，不仅回收率低，况兼也惟有小分子量的杂带能去掉。因为在我的计划带底下不久就有一个小的杂带，况兼我想把我的卵白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料分歧，况兼对于流速和柱子长度要求就很严格了。
有可能你的载量下跌了，是以才那样，你需要清洗了。
我以为你最佳选拔新的填料，其实你如果条目好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把咱们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。
72) 1。我的卵白bind在C4 column 上了，100％的ACN齐没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？
2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？
那实在不型可以磋议极性更低的乙酸乙酯等物资.此外洗不下来有莫得可能变性千里淀在柱子陡立不来，你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗，我以为出不来的原因有不少，不一定仅是洗脱的问题，是以用反相分离卵白如故得很留神，此外不知谈你的柱子是不是专门用于纯化卵白的，因为孔径太小也不得当分离卵白.
ACN 中含有1％的TFE。
有可能是卵白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？
不外在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像老是洗不干净
column 是专门用来纯化卵白的，是C4。 不知谈孔径是若干，不外C4的应该齐差未几把。
我以为如果是千里淀也有可能，要不你就少上点样，或者抑止上样的浓度，此外尽量洗脱要快点，用变性剂怕不是好的方法，因为浓度太高，很容易有变性剂析出，这样堵柱子或管谈更贫寒，你可以最先就增多点ACN 的浓度，这样吸附力毛病，你也可以添加点极性小的溶剂，这样可以幸免吸附力太强而洗脱困难.
我想柱子应该莫得问题.方法也莫得错.
73) 想请问细胞外基质中的卵白若何抽提。
这个可真的莫得作念过，不外一般的作念法齐是匀浆，然后用缓冲液提取，不知谈你的是什么起头的样品，此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取，我想细胞外基质中的卵白也应该是用这些方法吧.
74) 请问聚乙二醇的检测波长是若干？
聚乙二醇是莫得紫外接收的，是以莫得检测波长，即使有接收，那也只在210nm隔邻有弱终局接收，而好多物资在这个波长齐会有接收，是以检测它怕是窒碍易.
75) 若何有用的去除卵白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有用的方法？
你用透析或超滤试试吧，还有个方法是用冷的丙酮千里淀卵白，这样名义活性剂如故融解的，这样也可以去除.
用冷的丙酮千里淀卵白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？
丙酮很好去，很容易蒸发走了，你也可以用除盐柱子去除，但是如果它是和SDS一样能和卵白麇集，那用平方这些除盐，透析，超滤齐莫得办法去除，只可用千里淀的办法，况兼是用酸性丙酮千里淀才能去除.
76) 那么，mPEG-maleimide的检测波长是若干？
maleimide应该有紫外接收的，你可以用紫外分光光度器去作念全波长扫描，然后可以找到它的特征接收峰，用这个波长作念检测波长就可以，一般的HPLC带二极管布阵检测器也可以作念全波长扫描，或者你选几个波长作念HPLC也可以，只消莫得阻挠就可以了.
77) 我咫尺想纯化一种卵白，我的卵白是14kD的碱性卵白质，过程是这样的：原核细胞内卵白抒发，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，临了得到纯化的卵白。上头是一个进修的protocol，我一直莫得作念过卵白纯化，是以想向斑竹请问，HPLC上样量这样小，我有5ml的量，要多久才完成？
我以为为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢，平直过一步Source 15 S应该也可以，这样可以省去一步，尔后再上HPLC，其实如果你的纯化如果作念得好，不上HPLC也有可能，除非你们这个卵白要求纯度很高，HPLC也有大的柱子，1X25CM的，一次上样可以0.5mL，十次也就结束，我以为纯化如故尽可能无须HPLC的最佳，不然老本高，况兼不好放大.
78) 你好，我的宗旨卵白是GST会通卵白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌抒发，我想请问一下其纯化方法。
那很松弛，落空菌体，加pBS缓冲液稀释，上GST琼脂糖凝胶，然后洗平，用10mM还原谷胱甘肽洗脱，网罗洗脱峰就可以得到你的卵白.如果你的卵白是谅解体，那需要复性再纯化就可以了，我给你发一份咱们的材料供你参考.
79) 有莫得比较好的国产疏水层析填料，自然是作念卵白的？
国产也有相应的填料的，你pM你的邮件给我，我给你发一份国产的目次，不知谈你需要若干量呢.疏水其实和亲和一样，只消配基团密度一样，载量就差未几，还有便是刚性好就可以了，填料的合成也不是很深邃的，更不是不可逾越的.
80) 我的课题波及屡次不同卵白质的纯化，我现存海外的一个protocol可以参考，但国内实验室的条目有限，挂牵如果率性革新纯化方法，斥逐不睬想时又不好分析原因。十分地郁闷，想听听您的建议，不堪感恩！
我纯化的第一个卵白质，是由稀释复性而得的三个亚基组成的复合物，这里纯化的宗旨主如果脱盐更换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化过程)。我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml，下一步准备用透析脱盐及超滤浓缩，但对于超滤离心管的选拔还无脉络（条目有限不可能添置大型超滤诱导），上网查也不得要领，如果您有相关贵府，能不行发到我的邮箱？junewu@sohu.com. 对于浓缩的方法，冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺千里淀法各有何优劣？冷冻抽干法和硫酸胺千里淀法会不会龙套卵白的活性？蔗糖会不会影响后续的超滤?
我纯化的第二个卵白质，是经过酶催化的该复合物（110KD），这里纯化的宗旨主如果去除体系中未组成复合物的单个亚基（36KD、13KD、1KD）及36KD亚基的aggregate，海外的protocol保举用凝胶层析，但我商讨作念过的东谈主说分离的成果并不睬想（原因不清），我是应该优化凝胶层析的步地如故应该选用其它的层析方法？莫得蠕动泵和网罗器（惟有层析柱和低温雪柜）能不行作念凝胶层析?如果能作念如何尽量升迁其分离成果？选拔层析柱和填料有哪些原则和防护事项?
Native-PAGE时，样品的盐离子浓度和样品内的其它卵白质会不会影响电泳斥逐呈阴性？Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否只是在于： 凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS；样品中不加DTT或β-巯基酒精，不经100℃煮沸处理；电泳时保捏较低的温度(4℃)？
问题多多，实在是因为本东谈主是首次波及卵白质纯化领域的外行人，除了您保举过的书，您还能不行保举一些专门的网站、公司的操作手册（您如果有买了家具才能赢得的，能否也EMAIL惠赠？）谢谢！！！
1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以，这样体积不会变大，同期透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩，很方便，超滤包括离心管齐未低廉，况兼样品未几怕亏空多，是以我以为如故用松弛的方法好.
至于浓缩，有条目那用冷冻干燥，超滤齐是可以的，硫酸铵千里淀不行行为浓缩的妙技，因为它需要卵白到一定的浓度，况兼浓缩后的样品要除盐，回收率也不高，透析袋+PEG浓缩我以为亦然可以的方法，荒芜得当莫得超滤和冷冻干燥的实验室，况兼老本低，得当小量不得当大宗，蔗糖浓缩咱们用过，应该不好用.冷冻干燥和硫酸铵千里淀一般卵白齐不会失活的.蔗糖一般不影响超滤，只是粘度增多，这样超滤会慢的.
2.既然文献是用凝胶过滤，你也用实足莫得问题，我以为分离这些分子量别离比较大的，那凝胶过滤是可以的选拔，只消选拔好合适的填料，装好柱子就可以，层析的基本条目如故要的，包括泵，检测器，记载仪，要不很难知谈网罗也不方便操作.填料的选拔主要看你的计划卵白和杂质分子量的别离，举例你的110KD和那些36KD以下的，那你可以这样选拔sephadex G 75，你的这些36KD以下齐在它3000-80000之内，而你的110KD在外水体积平直就出来，后头的齐是小分子的，自然也可以选拔Superdex 75，它的分离范围在70000-3000，只是它们价钱不同，后头的填料刚性更好流速快，前边的低廉，流速慢些，这些就看你的经费了.
3.电泳别的卵白不应该影响，但是盐是有影响的，是以样品要除盐，可以用凝胶过滤，透析，超滤除盐.保捏底温也许是为了保捏卵白的活性，作念小量制备.
4.~purification/Purification_Protocols.html
这个网站有不少相关的材料，信托很有匡助，此外我可以把咱们全部的材料发给你，但愿对你有所匡助.
81) 如果分离50KD，36KD，13KD这三种卵白质，最佳选用那种凝胶层析用填料？如何信托需用的层析柱的直径和高度？
2.如果实在莫得泵，上样时应防护些什么？莫得检测器和记载仪，最短的网罗终止时期是多长？
选拔sephadex G75或者superdex 75，柱子的大小一般齐是按你的处理量算的，平方的柱子大多是1.6x60，2.6x60，或者有100cm的柱子，内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般齐不会有问题.
2莫得泵那我以为凝胶过滤很难网罗样品，除非你用自动分部网罗器按一定的体积去网罗，然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度，这样再把柄每管的卵白浓度作念个色谱图，按峰型把各管合并，上样防护要沿柱子的四周迁延加，最佳先把底下出口阻滞，让液体不流动，上完样品后再开放下口，这样可以保证上样比较均匀，当胶平面莫得液体的时候再用你的均衡液体按上样的方法加就可以，然后再开放下口，千万别让液体流干，也不行把胶平面冲坏.网罗的时候可以按5m或者10ml一管，时期是把柄你柱子的流速.
82) 请问那里相关于免疫组化Ｓ－Ｐ法具体操作步地的贵府？
SP免疫组化法，全称链霉菌抗生素卵白-过氧化酶承接法。你购买的哪家试剂盒齐有很迁延的方法，或者你上一些提供试剂盒的公司网站议论他们齐可以得到迁延的材料.
底下的文献你可以望望.
83) 师兄你好，
我有一个问题想请问，在以前的贴子中莫得看到。我要作念抗体的真核抒发，为分泌抒发，抒发出来的卵白莫得标签，因为但愿尽可能保捏抗体的结构，因此不行用那些针对组氨酸等标签的的柱子，我的抗体是个会通卵白，简短是IgG的三分之二大小，是sCFv和CH3承接而成二硫键承接的双链，莫得CH2区，我看proteinA和proteinG柱子齐是要麇集FC，那我的卵白FC子虚足的话还能用吗？要不我若何办啊？还有，对于莫得标签的抗体是不是无法和细胞培养使用的小牛血清中存在的抗体样物资分开呀？是不是必须要无血请培养。我简直不知谈该若何想象实验啦。谢谢。
你好，我看的书上说CH3是FC受体的麇集区，而C H2是补体麇集区，这证据卵白A和卵白G应该是和CH3麇集的，你可以抒发出来用卵白A或G的试试，此外抗体有很好的疏水性，用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片断，包括单链抗体，至于血清中的抗体，它们和亲和柱子以及疏水等的眇小别离通过篡改洗脱条目得到纯化，自然你可以用无抗体的血清培养或无血清培养，我以为你如故选抒发出来再说了，而血清中的白卵白很容易用染料亲和的方法就可以去除。
84) chromatography，您好！我咫尺用的Ni-NTA进行亲和纯化一个约45KD的卵白，对于菌体的落空，有东谈主保举用溶菌酶，有东谈主说超声波，我用溶菌酶试过一次，但1200undefined20min离心后，上清中莫得宗旨卵白，你能不行将相关的材料也发给我一份
用超声落空的比较多，如果你有诱导的话这样落空比较好，因为时期短，落空成果也好，而溶菌酶子虚足，况兼不大好操作，我不若何作念上游，不很了了，你可以再仔细问问别东谈主相关落空的问题，纯化的材料我给你发一份，但愿对你有所匡助.
85) 如果裂解液中加了一些卵白酶阻扰剂，纯化时要不要磋议尽可能临了去掉这些卵白酶阻扰剂？
一般添加的齐是小分子的物资，况兼也不会和计划卵白麇集，纯化过程一般就去除了，是以无须荒芜磋议去除的问题.
86) 选拔sephadex G75或者superdex 75，柱子的大小一般齐是按你的处理量算的，平方的柱子大多是1.6x60，2.6x60，或者有100cm的柱子，内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般齐不会有问题.
1，咱们实验室莫得sephadex G75(3000-80000)，最接近的便是sephadex G100(4000-160000)，况兼齐是80年代的家具，如何判断还能不行用？网上可以找到这两种填料的证据书吗?
2，您所说的处理量指的是样品的质料(mg)如故上样的体积(ml)?就我所知有两种筹商方法。其一是把柄质料算：卵白质工夫手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是卵白的质料(mg)，柱的长度=柱直径30，但这个柱直径 的筹商公式我没看领悟，用不上；其二是把柄上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您平方是若何筹商的?(具体到我所要分离的卵白上样量是1ml，包含杂卵白的总质料是4mg)
3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?
1.G100刚性不好，容易因为压力，盐变化而体积篡改，实在莫得办法也只可用这个，但是你要保捏恒定的流速，，盐或缓冲液的浓度，这样才能保证有很好的分离成果，证据书我想不好找，但是它和系数的sephadex处理是一样的。
2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，平方上样量是柱床体积的5%足下应该，如果很接近，也可以抑止到2%，你的1ml样，1.6x60cm的填塞了。
3。一般稀释至少在2以上。
87) 还有个小问题，是不是G后头的数字越大，就刚性越差，越容易受外身分影响？
是的，G后头的数字越大，就刚性越差，越不耐压和盐溶液。
88) 我抒发的是带有GST的会通卵白，醇化后需用凝血酶切割，我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?
是一样的，但是用于酶切的要求的纯度更高。
89) 在作念WB，因为是血清标本，含有较多的白卵白，可能影响我的实验斥逐。我请问过ptglab楼主，他保举我来这儿问一问。请问妙手有什么方法吗？哪一种比较松弛经济？蓝色琼脂糖凝胶可以分离吗？
用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除，我以为很快也很特异，样品平直穿过柱子白卵白就可以去掉90%以上，你pM你的邮件地址给我，我给你一份相关的材料，咱们这里就有这个填料。
90) 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析上样时，对样品宗旨卵白浓度的要求是不是一样的？样品浓度一般要求在多大范围内？
凝胶过滤处理样品量主如果受体积的影响大，浓度相对要小一些，上样量在床体积5%足下，如果是除盐可以上到20%足下。
其他的主如果上样的浓度，一般就在5-10mg/ml填料，具体的情况得看填料的载量和使用证据。
91) 我问的真义 是在纯化过程中，如果卵白酶阻扰剂去掉了，而该卵白酶还未去掉，我挂牵此卵白酶还会消化我的宗旨卵白，请问我说得有莫得兴趣？有莫得必要磋议？
你可以用抗体作念WB检测你的纯化的卵白，如果照实有酶解的风物，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些阻扰剂，然后再作念对比，我以为你磋议得很周全，这个亦然值得防护的问题，但是纯化的过程时期不长，一般莫得必要这样作念，但是有的卵白有降解的风物，那就加试试。
92) 离子交换层析、亲和层析上样时样品的卵白浓度可以达到5-10mg/ml？我以为浓度是不是太大？
对不起，莫得说了了，我的真义是填料的载量大多在这个范围，是以上样的若干由填料对你的计划卵白的载量相关，也和填料的性质相关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也莫得什么关系，因为其中信得过你的计划卵白不一定很高，是以其实这样的浓度也没相关系，具体的量和浓度如故要经过实验才知谈。
93) 落空菌体，加pBS缓冲液，计划卵白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的卵白是谅解体。
那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍融解谅解体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是融解不了你的计划卵白的，你的卵白再落空后的千里淀里，不在上清中。
94) 你好，我最近作念纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow作念初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在雪柜里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪风物，系数这个词胶变成了絮状， 千里子虚，我一看，旧胶里面是有好多絮状物（不是其它东西，亦然胶）漂在上头，底下千里淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时候层了，絮状物在上头，底下是胶，我于是裁撤了上头的东西，把底下的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC
处理了三次，结束，又变回当初的絮景况了，象褂讪的絮状胶体一样，真不知到底若何回事（也便是说加盐它就能千里，加水就絮状胶体），我的胶是不是不行用了？
另外，我作念亲和，宗旨卵白底下有两条带若何齐去不掉，我的卵白是4聚体，是不是作念SDS－page将它 解离了？我计议作念native望望，但是高效液相斥逐清楚很纯的，只是主峰后头有个雷同拖尾的小峰，不知谈是不是莫得分离开，想请你帮我指点一二，另外能不行先容下亲和方面的贵府，荒芜感谢
你的旧填料是若何保存的呢，是在20%的酒精中的吗，你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗，先用水洗，然后再用0.5MNaOH洗三次，再用20%酒精洗，70%酒精洗，水洗，这样你再取出胶在水中混悬望望，应该就好了，如果不好，那就莫得办法了，但是一般这样处理当该莫得问题.
亲和你用的是什么方法呢，什么填料，HPLC又是用什么柱子呢，是反相吗，我以为你得先说了了这样才好分析.
95) chromatography兄，很感谢你的匡助，我这里莫得抽滤漏斗，请问那里可以买?贵吗? 我来日用你说得办法处理几次，望望有莫得办法护士，如果莫得抽滤漏斗，是不是有什莫替代品那?
亲和我使用的是sephrose cl 6B，配基是酶的底物，我的酶是有4个亚基的团聚体，共同存在时才有活性，那两条杂卵白带在SDS-PAGE中位于主带的底下，洗脱选择底物雷同物等pH浓度梯度洗脱，奇怪的是高浓度洗脱纯度较高，一般可以去掉其中的一条杂卵白，但是另外较小的那条基本很难去除，有杂卵白存在时酶活通常抑止的好快，请chromatography兄帮我分析分析原因，很感恩.
这样的砂心漏斗试剂公司就有，不贵，一套也就300来元，莫得抽滤还莫得别的好代替了，也可以用中间夹膜的漏斗。
至于你说的两条带，那按理你用底物雷同物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢，你均衡用什么条目，洗脱呢，你用什么活化的填料，我以为非特异吸附的情况是存在的，你可以篡改洗脱的方式，平方这些非特异吸附是离子交换作用，你可以可以在均衡液里增多点盐，这样可以去除这样的吸附，此外你计划卵白会不会降解，这样有小分子还一样被吸附，你可以通过抗体作念WB望望，如果是这样，那只可在纯化过程中加一些酶的阻扰剂来幸免。
我能意料的便是这两种情况了。
我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，临了加入配基，选择pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液均衡，洗脱是等PH条目下进行的，只不外篡改了洗脱剂的浓度，从最大浓度洗脱的斥逐看，通常就少了其中一条带，你的解释我会负责想考的，亲和中存在离子吸附，是不是计划卵白和杂卵白的等电点很接近酿成的？均衡液中加点盐，主要起什么作用？一般加若干？使用什么盐好那？如果是我的卵白解离，这样的杂卵白有莫得什么别的方法洗掉（除了加酶的阻扰剂）？
你其实如故莫得说了了你活化的方法，看你的真义好象是环氧活化的方法，不知谈你是若何偶联的，如果你以为是玄妙，那也没相关系，只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附，总之如果氨基和羧基缩合的方法，不免有离子交换作用，溴化氰亦然这样的，而如果是环氧活化的方法，那么就莫得离子交换的非特异吸附，至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也填塞了，如果是因为降解，那也许用这样亲和的方法就得把条目摸更缜密点，如果不行，那可以看凝胶过滤能不行分开，即使不是降解，你也可以磋议凝胶过滤，而从你反馈的情况好象杂质是个酶，加点阻扰剂望望吧。
真的谢谢你忘我匡助，我来到这个公司之前，他们就 曾经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，临了加入配基』，我也不知谈为什么，和经典的环氧等方法不一样，咱们偶联剂用的是10个C，培基是带氨基的，硼氢化钠应该是还原剂的，基质是sepharose cl－6B，具体对这方面我不是很了解。我想最近作个native，和SDS对照一下，望望是不是降解，此外，这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。
我就把胶放在柱子里，加上碱洗了三次，上头的水平直吸走，然后水洗，在加浓盐洗了两次，上头就悠扬着一层悬浮物，我留神再把它从上头吸走，之后在水里面好像就很好了，显微镜下我仔细看，与新胶没什么区别，谢谢你的匡助哦，我只是莫得砂心漏斗，没法子试试汉典。活化的方法是什么？我我方齐不了了.
96) 1、咱们用CM52大宗纯化某卵白，常常会碰到介质间隙，不知什么原因？
2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗？如果为5/7会对分离有很大影响吗？用PB或ABS均衡时你们一般用若干柱床体积？
3、咱们用5KD超滤浓缩后卵白的亏空很大，能否维护分析一下原因（PALL 的超滤器）？
那也许是因为有气泡，积贮到一定地步后就穿过介质是以间隙，你流速不行太快，况兼缓冲液脱气，这样就应该好了.
2.一般离子交换莫得必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也齐是这样的就可以，莫得刻意要求，5/7应该影响也不大，自然如果你走线形梯度洗脱，也得当把这个比值增多点，如果走阶段洗脱就没相关系。
3。超滤膜自己的面积不小，这样也会吸附卵白，荒芜是处理的量比较小的情况亏空会很显豁，如果量大，那亏空会小的，此外如果卵白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要荒芜留神，因为失活会很显豁的。
97) 我作念的是原核抒发卵白质，宗旨卵白是一个GST-会通卵白，咫尺通过SDS-PAGE电泳发现宗旨条带曾经抒发出来了，正在作念纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该惟有宗旨条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100，但再作念电泳发现杂带还有几条，但宗旨条带却不见了，
1.为什么宗旨条带不见了？
2、下一步应该若何办呢？
如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽作念阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，裁汰作用时期，在你的均衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是
triton-100阻挠麇集，是以不行用，你用吐温也碰侥幸，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的卵白有降解风物，你可以用抗体作念WB检测望望是不是齐是你的计划卵白，总之修改的决策便是我说的这几个，摸索一下吧。
此外可以选拔作用劲更毛病的填料。这样有利性更好。
98) 手头有碱性磷酸酶的贵府吗？能否告诉我它的迁延结构 我想提纯 谢谢拉
最佳还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间，大致80K（四聚体）、32KD（二聚体），它耐高温80度仍然保捏活性（在有镁离子存在的情况下），最适PH8.0
我咫尺已粗步提取下步想层析， 你看该选拔什么材料填柱
卵白莫得什么迁延的结构吧，至于纯化它既然是碱性的卵白，那你可以平直用阳离子柱子作念粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂卵白就千里淀了被去除，再上离子交换就应该有可以的成果。
填料可以选拔CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。
99) 前几天我提取了一种菊科植物的卵白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮千里淀卵白，斥逐卵白中含有色素杂质，属水溶性，色调很深，请问妙手，如何裁撤色素阻挠，纯化卵白？另外我也查了一些贵府，说可能是花色素，于是我在100%丙酮千里淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并莫得显贵的成果。
你说的花色素便是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，是以丙酮千里淀它也千里淀，你可以改用酒精千里淀或者硫酸铵千里淀，这样色素就不会被千里淀了，你试试吧。
100) 用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)均衡时你们一般用若干柱床体积？10X够了吗？
一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要均衡体积大点也，10X填塞了
101) 有个对于胰岛素精纯化的问题想向你请问，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又若何作念呢，谢谢赐教。
我知谈，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子作念制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难作念到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点千里淀的办法去掉一些杂质。
HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也便是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后升迁浓度洗脱，迁延的条目和你作念反相纯化是一样的，只是HPLC的分离成果更好。
102) 请问若何可以查到protein的PI值？，多谢了先！
已知的卵白自然是查贵府，未知的如果知谈序列的话，可以用软件，你在论坛中搜索吧，有不少帖子的.
103) 谢了chromatography兄，也便是必需用小颗粒的硅胶填料了。
是的，需要用HPLC作念制备，或者你优化的你工艺，看能不行升迁纯度.
104) chromatography兄:
荒芜感谢回复，我手里也有一个GST会通抒发的容颜，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。
宗旨卵白是12KD足下，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条目酶切时，反应液发混，全部千里淀，切出的卵白（约12KD）经尿素融解，透析后，PH6.0不行挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条目酶切时，也有发混，但宗旨卵白有14KD足下，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条目有问题？
另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:zhangxstc@yahoo.com.cn
别客气，有千里淀也许是卵白在那样的pH下融解度不好，或者因为缓冲液的原因，挂不住会不会是莫得切开，是以挂不柱.最佳用电泳望望切的成果如何.
至于落空我不很了了，酶切你可以参考底下的东西:
~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins
105) 我想用DEAE纤维素来作念填料
我的粗提酶液卵白含量简短为7mg/ml我该选拔哪个型号的DEAE呢？
DEAE纤维素如果消亡家公司的别离不大，最常用的也便是DEAE纤维素 DE-52，其实我以为你如故选拔DEAE琼脂糖凝胶，流速也快，好用，莫得什么必要一定用纤维素，何况价钱也未低廉.你作念的是什么酶呢.
106) 我想请问一下您在装柱（尤其是分子筛柱子）是否是按照填料的证据正向装呢，如故反向装？
我两种方法齐试过的，但是惟有一次是正向装完后，检测效价为30，000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外，还有莫得其他要防护的。最佳能给我一个Protocol。谢谢！
另外，还有一个问题，我有一个90kD的会通卵白（连GST），用GST的亲和柱纯化后老是有50多kD和20足下的杂卵白。我用Sephacryl－S100能去掉它们吗？或者您可以给我一个更好的建议
1，我不解白，自然是正向装了，反向若何装呢，其实装柱子只消均匀就可以，我简直没测定过柱效，也莫得Protocol，因为一般装的齐莫得问题，只消防护你说的几个问题就可以。
2。至于纯化的杂带你用抗体作念WB看是不是降解的物资呢，你可以优化你纯化的条目，在均衡液体中升迁盐的浓度，这样可以抑止非特异吸附，这样再作念作念看，此外你可以用5mM，10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱望望有什么斥逐，我以为你先优化完如果莫得纯化好，再用凝胶过滤吧，你可以选拔sephadex G75或者是Superdex G-75，这样你的计划卵白在外水体积中出来，后头的杂质在内水体积中，这样成果会更好点，如果用前边的S100不会比后头的两个填料成果好的。
107)
108) chromatography 年老
我作念的是碱性磷酸酶，简短32KD，我咫尺只作念到硫酸氨盐析粗提，想跨越纯化，你那有莫得层析方面的贵府，（比如材料的选拔原则、洗脱液的选拔、操作等方面）
这个卵白硫酸铵千里淀后你可以平直用疏水，要不就透析，然后上阳离子交换的柱子，这样纯化不知谈能到若干纯度，此外可以用亲和的办法，我看到的是把物资偶联到琼脂糖凝胶上作念亲和，举例对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以，这是比较好的方法.我给你发一份填料选拔指南吧，也许会有的有点用处，此外把我见到亲和的文献发给你一篇
chromatography 年老， 谢谢你拉， 贵府我收到了， 我先望望还有问题在找你维护了，定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶， 新式染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化 是什么步地的我这解压缩后打不开了
文献是zip步地的，有winzip这个软件就可以开放了，应该很常见的.
109) chromatography 忙活
我想纯化碱性卵白酶， 具体方法想象如下:
65%硫酸胺千里淀，透析袋.
但是我的卵白酶卵白含量不亏空是严重，不知谈还有什么好的方法浓缩.
下一步纯化方法DEAE50， G200两种填料
不知谈防护什么?谢谢
别客气，我不太了了你说的但是我的卵白酶卵白含量不亏空是严重，是什么真义，是亏空严重吗，按理透析不应该有太大亏空的，你可以用缓冲液把透析袋里面洗几次，这样能抑止你的亏空.其实上离子交换，不需要浓缩，平直上就男同porn
