Fiber-seq91 麻豆

染色质是DNA与组卵白和非组卵白联结酿成的动态复合体，它的三维结构径直影响基因抒发、基因组稳当性和细胞功能。但是，染色质结构是高度复杂且动态的，这对研究其结构与功能之间的关连提倡了诸多挑战。准确量化非编码嵌合变异的功能需要将DNA序列与单个DNA分子上的可及和禁闭的染色质结构配对，而这种配对是无法使用传统的基于碎屑的染色质分析竣事的。跟着单分子测序本事的发展，长读长测序（如PacBio的三代测序平台）成为研究基因组与表不雅遗传学的有劲器用。长读长测序不错提供大边界的基因组信息，同期为研究复杂的基因组结构（如重复序列、插入和缺失等）带来了新的可能性。

Targeted Fiber-seq本事是一种高分辨率的染色质分析形状，不错在单分子水平上同期分析染色质的基因组序列、表不雅遗传象征（如CpG甲基化）和染色质可及性，不错精确地揭示染色质的结构变化和基因抒发的调控表情。

本体应用

2024年7月，bioRxiv上发表了一篇名为Resolving the chromatin impact of mosaic variants with targeted Fiber-seq的著作。这篇著作主要探讨了嵌合变异（mosaic variants）对染色质结构和功能的影响，非常是在基因组中的千般性若何影响细胞内的染色质构型。为了克服现存形状在研究嵌合体突变时面对的挑战，研究东说念主员使用了Targeted Fiber-seq，并应用该本事揭示了嵌合体突变若何影响染色质的调控。通过这一翻新形状，研究者偶而更准确地贯通嵌合体突变对染色质影响的具体机制。

Part 1

Targeted Fiber-seq践诺历程如图1a所示：研究东说念主员提真金不怕火细胞核酸后，使用m6A-MTase处理并象征染色质中的盛开区。随后使用CRISPR/Cas9本事获取靶向核酸大片断，通过SAGE-HLS进行大片断回收。临了将核酸片断打断成10-15kb的片断，在保留修饰信息的前提下，使用PacBio进行测序。为了考证形状学上的可行性，研究东说念主员领先将Targeted Fiber-seq应用于培养的淋巴母细胞(GM04820)。在统共三个办法位点上竣事了101-164倍的中位笼罩度（图1b、c），与全基因组形状比较，极度于约20倍的富集（图 1d，形状）。在统共样本中获取了10倍的中位富集率（图 1e）。同期，全面、深度笼罩的表不雅遗传图谱揭示了单个染色质纤维的染色质结构中存在显著的异质性（图1f）。研究东说念主员考证了在单分子水平上精确拿获和分析染色质上的表不雅遗传修饰。这对于开发新的基因组剪辑和表不雅遗传学研究器用具有报复风趣。

图1. Targeted Fiber-seq形状。a) 有野心示意图。b) 披露在靶向基因座上的 Fiber-seq 百分比驱动（红色）、ENCODE DNase I-seq（蓝色）和每个碱基的靶向 fiber-seq 笼罩率。c) 与非靶向区域 (chr14:20283833-20402650， hg38) 比较，靶向区域每个碱基笼罩率的小提琴图。d) 相对于 WGS 的靶向基因座的相对富集 (形状)。e) 统共样本和办法的相对富集。f) 放大证明性基因座，披露单个纤维中的 m6A 事件（紫色刻度）。

Part 291 麻豆

紧接着，研究东说念主员应用Targeted Fiber-seq本事分析肌强直性养分不良症1型（Myotonic Dystrophy Type 1， DM1）推敲的DMPK基因的CTG重复扩增对染色质结构、CpG甲基化以及染色质可及性的影响。DMPK基因CTG重复扩增是DM1的病理特征，这种重复会引起染色质结构和基因抒发调控的非常。研究东说念主员领先对来自DM1眷属中四名有症状个体的成纤维细胞中的DMPK基因座进行靶向富集。借助Fiber-seq研究东说念主员量化了具有单分子分辨率的的CTG重复扩增不稳当性，如图2a/b所示。三代个体间的互异证明了该变异的体细胞不稳当性。接下来，研究东说念主员运用底层高度准确的测序信息对160 kb办法区域内的每个供体的单倍型相位进行分析，从而笃定它是来自含有当年或致病性重复扩增的染色质纤维，如图2c。运用每条纤维上的成对 Fiber-seq 染色质结构，不雅察到假设的 SIX5增强子被1kb超CpG甲基化区域包围，而况染色质可及性在第二代和第三代的重复扩增单倍型中被大大放松。该遵循标明致病性 DMPK重复扩增通过上游CpG甲基化和染色质可及性的局部更变梗阻染色质，并示意这种上游增强子样元件是SIX5的增强子。

图2. DM1成纤维细胞中DMPK 3’ UTR CTG 扩增处单倍型贯通的染色质可及性和 CpG 甲基化。a)代表成纤维细胞供体的眷属谱系。每个局势内的标签分手代表致病和当年等位基因内的 CTG 拷贝数。b)全王人超越 CTG 重复的测序读数中的 CTG 计数，按单倍型分组。c) 通过浏览器轨迹图比较了当年等位基因与病感性等位基因（来自第一、二、三代）的染色质结构。图中展示了CpG甲基化水平的互异（黄色至红色流露p值从0.01到0.0001），以及当年（浅蓝色）、第二代/第三代扩增（红色）和第一代扩增（绿色）等位基因的染色质可及性百分比。d) CTG 相邻 CTCF 联结位点的 CTCF 萍踪。要是萍踪与甲基化明锐斑块全王人重迭，则将其归类为可及的，要是可及的萍踪不包含任何m6A，则将其归类为 CTCF 联结。e) 展示了在当年和扩增纤维之间，每个可及峰值的染色质激活互异。x轴流露激活互异，y轴流露p值。图中的绿色和红色点分手代表第一代和第二/三代的比较遵循。f) 在 e 中神态的峰值处绘图 CpG 甲基化互异与染色质驱动互异的关连图。

Part 3

同期，研究东说念主员应用Targeted Fiber-seq本事研究在HBG1/HBG2运转子中通过碱基剪辑（ABE）引入特定突变后对染色质可及性和CpG甲基化的影响。该部分中作家提倡，他们对HBG1和HBG2运转子的碱基剪辑若何影响胎儿γ珠卵白抒发的机制透露受到了挑战。因为碱基剪辑每每是不无缺的，这导致细胞群体中剪辑和未剪辑的单倍型的混杂，而况HBG1和HBG2基因位于高度不异的节段重复内，在近端运转子上具有 100％ 的序列归并性，短读长测序表情会限度对该区域进行互异化分析。

作家运用ABE将HBG1和HBG2运转子中的BCL11A联结位点突变（A>G）。再将剪辑后的CD34+造血干细胞分化为红细胞，进行Fiber-seq分析。研究发现，BCL11A联结位点突变后，HBG1和HBG2运转子的染色质盛开性显耀提升（>100%）。同期，运转子区域的CpG甲基化水平裁汰，进而再行激活了胎儿血红卵白的抒发，为心源性暴毙和β地中海贫血的治愈提供了表不雅遗传调控的新计策。如图3所示。

图3. HBG1/HBG2运转子内的BCL11A元素的治愈性碱基剪辑。a) 践诺范例示意图。b) 序列记号披露 HBG1和HBG2运转子中 BCL11A 联结位点内的碱基剪辑。字母高度对应于相对碱基频率。c) HBG1 和 HBG2（黄色）、仅 HBG1（深灰色）、仅 HBG2（浅灰色）和两者王人莫得（蓝色）的 BCL11A 位点被剪辑的纤维百分比。前三个类别在 d 均分组为“已剪辑”读取。d) ABE 剪辑的 CD34+ 繁衍红细胞的 UCSC 浏览器轨迹。（顶部）在办法区域内的统共纤维映掷中，比较处理的多能祖细胞的 ENCODE DNase-seq（蓝色）和 CD34+ 繁衍红细胞的染色质可及性（Fiber-seq FIRE）。（底部）放大并比较 HBG1 和 HBG2 中已剪辑和未剪辑的纤维。比较了 CpG 甲基化的互异，以及未剪辑纤维（蓝色）和 HBG1 和/或 HBG2 剪辑纤维（粉色）的驱动百分比。底部披露了剪辑读取的峰值调用和每个峰值的劝诱百分比。

总体而言，著作证明，Targeted Fiber-seq偶而生成靶向长读长测序染色质图谱，从而以单分子精度贬责遗传和染色质结构的异质性。报复的是，由于Targeted Fiber-seq偶而同步测量归并DNA分子序列（≥10kb）、CpG甲基化和染色质可及性，咱们不错径直解开不同类型的遗传变异对周边基因调控要领的功能影响。将其应用于DMPK和HBG1/HBG2基因座标明，精确的遗传变异可能导致染色质可及性的复杂更变。与此同期，研究东说念主员强调短读长测序形状不妥当识别可能因变异而更变的周边调控元件，因为读万古时小于150bp，从而导致对嵌合体变异若何影响基因调控结构的办法过于短视。

PacBio精确长读长HiFi测序是竣事Targeted Fiber-seq的要害器用，其特有的本事上风为研究染色质结构和表不雅遗传特征提供了强大援手。精确长读长测序才智为研究重复序列扩增和复杂区域（如基因组插入/缺失）的结构变异提供了强有劲的本事援手。单分子分辨率使研究东说念主员偶而同期获取基因组序列、表不雅遗传修饰和染色质结构的多维信息，为透露嵌合突变若何影响染色质功能提供了精确器用。高笼罩度增强了Fiber-seq在检测低频嵌合突变和复杂区域的可靠性，为准确研究这些变异的功能效应奠定了基础。

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